TwitterLinkedinWhatsAppTelegramTelegram
0
2
Читайте эту статью в:

Ограничения метода ПЦР в диагностике РРСС

Методом ПЦР можно обнаружить вирус в, практически, любом материале, но означает ли это, что если проба содержит вирус, то этот вирус заразен? Годится ли любой ПЦР-тест для любого штамма?

Для обнаружения РРСС наиболее широко используются два метода: ПЦР и ИФА (ELISA). В настоящей статье мы сконцентрируемся на ПЦР, методе, способном обнаружить вирус в, практически, любом материале. Он основан на полимеразной цепной реакции ДНК, или, в случае с РРССв, областей комплементарной ДНК (кДНК), фланкированных короткими последовательностями, с которыми специфичные ДНК-праймеры связываются на каждом ПЦР-цикле. Чувствительность и избирательность диагностических тестов, использующих ПЦР, зависят от того, насколько эти праймеры соответствуют своим целям и от термических циклов в процессе циклической амплификации. В идеале, они должны быть комплементарны только геному заданной разновидности вирусов, не связываясь ни с какими другими микробами или цепочками хозяйской ДНК, при этом, способными определять геномы всех штаммов или вариантов этих видов вирусов. Таким образом, они нацелены на наиболее консервативные области генома.

Вирус РРСС (РРССв) – один из самых сложных для разработки высокочувствительных и специфичных тестов ПЦР возбудителей. Известные в настоящее время вирусы РРСС относятся к двум видам: РРССв-1 и РРССв-2. Обе эти разновидности распространились по всему миру, при этом, РРССв-1 доминирует в Европе, а РРССв-2 – в Америке и Азии. Можно предположить, что генетическое разнообразие доминирующей разновидности РРССв выше, чем таковое вида с меньшей превалентностью. На практике, ПЦР-тесты, используемые, например, в Европе или Америке, могут быть более валидированы и лучше приспособлены к выявлению РРССв-1 или РРССв-2, соответственно. В результате, некоторые штаммы менее распространенных разновидностей на данной территории, или континенте, могут остаться незамеченными, а их роль в патогенезе РРСС – недооцененной. Это особенно важно, если речь идет о фермах, где РРССв-1 и РРССв-2 циркулируют совместно. Огромная генетическая изменчивость вирусов РРСС требует постоянного обновления последовательностей ПЦР-праймеров и зондов, чтобы поспеть за непрестанной эволюцией вируса и за появлением совершенно новых генетических вариантов. Особенно это относится к РРССв-1, чья крайняя генетическая изменчивость, вкупе с малодоступностью референсных вирусов из России, Беларуси и Украины представляют угрозу в плане нарушения чувствительности имеющихся на рынке комплектов ПЦР-тестов к Восточноевропейским генетическим подтипам РРССв-1.

В настоящее время такой вариант, как ПЦР в реальном времени, используется для, преимущественно, повседневной диагностики. Существует несколько методов ПЦР в реальном времени, отличающихся по своим принципам, но наиболее широко применяемым из них является метод с использованием так называемых TaqMan-зондов. TaqMan-зонд – это короткая область ДНК (олигонуклеотид), помеченная флуорофорами, которая связывает ДНК-мишень между фланкирующими праймерами. Если связывание произошло, зонд в лизирует в процессе полимеризации ДНК и флуоресцентное свечение регистрируется оборудованием. Особенно ПЦР в реальном времени подходит для мультиплексирования диагностических мишеней. Это означает, что одной ПЦР-реакцией (или одним тестом) можно выявить 2-3 различных патогена – по флуоресцентному свечению 2-3 различных красителей. Таким образом, одновременно обе разновидности РРССв могут легко быть обнаружены и дифференцированы в пробах, полученных от одного животного, из станка или со всей фермы.

Рисунок 1. Пороговый цикл (Пц) – самое первое порядковое значение цикла ПЦР в реальном времени, на котором обнаруживается флуоресценция, что будет свидетельствовать о присутствии в пробе данного патогена. Чем ниже значение Пц, тем больше в тестируемом образце патогена. Очень высокие значения Пц следует интерпретировать с осторожностью, поскольку их причиной может послужить самопроизвольный выход из строя TaqMan-зонда на очень поздних циклах, а не присутствие в образце ДНК-мишени.

Рисунок 1. Пороговый цикл (Пц) – самое первое порядковое значение цикла ПЦР в реальном времени, на котором обнаруживается флуоресценция, что будет свидетельствовать о присутствии в пробе данного патогена. Чем ниже значение Пц, тем больше в тестируемом образце патогена. Очень высокие значения Пц следует интерпретировать с осторожностью, поскольку их причиной может послужить самопроизвольный выход из строя TaqMan-зонда на очень поздних циклах, а не присутствие в образце ДНК-мишени.

Расшифровка результатов ПЦР обманчиво проста. Ветеринарные специалисты должны быть в курсе некоторых ограничений данного метода и быть в состоянии критично подходить к расшифровке результатов. Например, положительный результат ПЦР подтверждает присутствие полинуклеотида-мишени (т.е., РРССв) в пробе. Тем не менее, этот результат не доказывает, что в пробе содержится патогенный вирус. ПЦР в реальном времени позволяет квантифицировать вирус в пробе. Ее результаты выражаются в виде «порогового цикла» (Пц). Это первый цикл, на котором зафиксировано флуоресцентное свечение из реакционной пробирки. Чем ниже порядковое число цикла, тем выше число копий ДНК-мишени (читай, число копий вируса). Например, проба с Пц 20 может считаться в высокой степени положительной, а проба с Пц 35 – в низкой степени положительной. Тем не менее, в некоторых случаях флуоресценция обнаруживается только лишь на очень поздних циклах ПЦР в реальном времени, т.е., >38. Как такие высокие значения могут быть истолкованы? К несчастью, не всегда такой результат отражает присутствие очень небольшого количества копий вируса в образце. Эти, так называемые, «засони» могут быть результатом самопроизвольного выхода зонда из строя в результате большого числа термальных циклов ПЦР, что будет выглядеть как энзимный нуклеозис, вызванный ДНК-полимеразой. Стало быть, такое может произойти даже при отсутствии нуклеиновой кислоты вируса в пробе. Правильная интерпретация «засонь» при мониторинге свободных от РРССв популяций имеет важнейшее значение. Должна проводиться повторная диагностика, включая ИФА (ELISA). К несчастью, некоторые европейские диагностические лаборатории не предоставляют клиентам точные значения Пц при ПЦР в реальном времени. Вместо этого, результаты показываются как положительные или отрицательные. Полезность таких отчетов для практических специалистов весьма ограничена, а в некоторых случаях они могут стать причиной принятия неправильных решений в плане схем борьбы с РРССв.

Практические соображения

  • Ни один из современных методов ПЦР не способен выявить все вируса РРСС.
  • Отрицательный результат ПЦР-анализа нескольких случайным образом забранных на ферме проб не доказывает отсутствие на ней РРССв-инфекции.
  • Положительный результат ПЦР доказывает присутствие в образце нуклеиновой кислоты РРССв, но не его, вируса, инфективность.

Комментарии к статье

Эта область не предназначена для консультаций авторов по поводу своих статей, это место для открытых дискуссий между пользователями pig333.ru
Оставьте новый Комментарий

Ограниченный доступ пользователям 333. Чтобы отправить комментарий, Вам необходимо авторизироваться

сопутствующие статьи

Схема выявления вируса и антител после контакта с РРСС: Данный график показывает изменения концентрации (ось Y) во времени (ось Х) различных аналитов, используемых при анализе. После контакта с РРСС вы обнаружите вирус в крови свиней (виремия), что обычно длится примерно от 2 до 4 недель, в зависимости от возраста и иммунного статуса свиней. Сероконверсия (обнаружение антител) обычно появляется в период 7-10 дней после контакта и длится несколько месяцев, затем животное становится серонегативным. Нейтрализация антител появляется в период от 4 до 6 недель после контакта (López и Osorio, 2004).

Лабораторная диагностика: Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)

Какие методы лабораторной диагностики я использую для диагностирования РРСС? Какой из методов я выберу в зависимости от ситуации? Как интерпретировать результат?

Фото1. Помещение для выращивания свинок на территории фермы. Фото доктора Марии Хосе Клавийо 

Акклиматизация свинок к вирусу РРСС. Существуют различные подходы для различных регионов?

Каков предпочитаемый способ экспозиции? и наилучший статус вводимых свинок? их необходимо выращивать на ферме или покупать? …Ветеринары-практики из Германии, Северной Америки, Китая и Испании делятся своими мнениями

Рис. 1. Геном вируса РРСС - одноцепочная молекула РНА.

Секвенирование вируса РРСС его применение на практике

Очень важно проанализировать новые последовательности PRRSV в сопоставлении с широким справочным набором, представляющим ферму, систему и регион, а также последовательности имеющихся коммерческих вакцин (это позволит выявлять различие между полевыми и вакцинными штаммами).

Собранные хвосты и семенники в герметичном пакете.

Использование производственных жидкостей для диагностики вируса РРСС

Мы предлагаем использовать в качестве образца жидкости, накапливаемые на дне ковша, когда фермеры собирают хвосты и семенники во время соответствующих процедур.

Рисунок 2. Применение карантина в 69 фермах

Ввод ремонтных свинок в репродуктор с РРСС-положительными свиноматками

Исследование проводилось в 69 РРСС-положительных репродукторах с целью сравнения вакцинации против РРСС модифицированной живой вакциной (MLV) и условий карантина со статусом по вирусу РРСС у ремонтных свинок при первом осеменении.

Рисунок 1. Отбор образцов у помета (используя для этого хлопковую веревку в отношении только поросят) и у семейства (используя для этого хлопковую веревку в отношении свиноматок и поросят).

Мониторинг вируса РРСС в племенном стаде – являются ли альтернативой жидкости ротовой полости у подсосных поросят?

Жидкости ротовой полости представляются практичными, быстрыми, легкими, экономически эффективными и надежными методами получения образцов у поголовья свиней, но это было не легко или удобно, чтобы получать такие образцы у подсосных поросят...