TwitterLinkedinWhatsAppTelegramTelegram
0
1
Читайте эту статью в:

ELISA как диагностический инструмент (2/2): интерпретация результатов

Вот что следует учитывать при интерпретации положительного или отрицательного результата ELISA.

Информация по интерпретации результатов:

  • Свиньям, подвергшимся воздействию патогена (дикого типа или вакцины), требуется время для выработки достаточного количества антител для обнаружения с помощью ELISA (обычно не менее 2-4 недель после контакта, в зависимости от патогена и целевого антитела).
  • Анализы ELISA на антитела не могут дифференцировать материнские антитела (пассивные антитела) от антител, вызванных воздействием (активные антитела).
  • Анализы ELISA на антитела часто не могут отличить антитела, вызванные вакциной, от антител, вызванных воздействием дикого типа.
  • В некоторых случаях могут быть разработаны специальные анализы ELISA для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (вакцины DIVA).
  • Результаты ELISA на антитела не предполагают защиты. Защита может исходить от различных антител, которые не могут быть измерены с помощью анализа, или с помощью клеточно-опосредованного иммунитета, который полностью отличается от гуморального иммунитета или иммунитета, опосредованного антителами, и не измеряется с помощью анализа ELISA.
  • ELISA на антиген значительно менее чувствителен (низкая аналитическая чувствительность) при обнаружении антигена по сравнению с ПЦР. Анализ ПЦР активно реплицирует присутствующую ДНК/РНК и, следовательно, может обнаруживать чрезвычайно низкие уровни вирусов или бактерий. С другой стороны, антигенный ELISA требует значительно большей концентрации вируса или бактерий, чтобы иметь возможность вызвать достаточное изменение цвета, чтобы его можно было обнаружить.
  • Результаты стандартизированы и обычно непротиворечивы в разных лабораториях при использовании серийно выпускаемых наборов ELISA (широкодоступных и широко используемых). Собственные лабораторные анализы ELISA могут давать большие различия в результатах, если производственная практика не является строго стандартизированной и несоблюдённой.
  • Не все патогены вызывают измеримый иммунный ответ
  • Каждый набор ELISA обычно тестирует разные белки, которые могут давать совершенно разные результаты для одного и того же образца. Ярким примером этого является множество различий в доступных наборах ELISA на антитела к Mycoplasma hyopnemoniae; определенно не все комплекты созданы одинаково.
  • Доза и/или путь воздействия могут влиять на уровень иммунного ответа (уровень выработки антител).
  • Важно знать сообщаемую чувствительность анализа (способность обнаруживать истинно положительные результаты) и специфичность (способность определять истинно отрицательные результаты как отрицательные; отсутствие перекрестных реакций).
  • Могут возникать ложноположительные и ложноотрицательные результаты, поскольку степень воздействия и иммунный ответ на патогены различаются между отдельными свиньями (нормальное распределение) и часто существует некоторая фоновая или перекрестная реактивность, которую невозможно полностью устранить (см. Рисунок 1).
  • Антитела обычно сохраняются/измеряются в течение нескольких месяцев после заражения/вакцинации.

Рисунок 1. Диаграмма, демонстрирующая пороговое значение, установленное для ELISA. Синяя кривая представляет собой нормальное распределение отрицательных животных. Оранжевая кривая представляет собой нормальное распределение подвергшихся воздействию животных. Указана область для ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Рисунок 1. Диаграмма, демонстрирующая пороговое значение, установленное для ELISA. Синяя кривая представляет собой нормальное распределение отрицательных животных. Оранжевая кривая представляет собой нормальное распределение подвергшихся воздействию животных. Указана область для ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Отрицательный результат

  • Образец/поголовье действительно отрицательные в отношении возбудителя (отсутствие воздействия и отсутствие вакцины).
  • Образец поголовья действительно отрицательный на возбудитель, хотя животные могут быть вакцинированы (если анализ имеет возможности DIVA) (ELISA только на антитела)
  • В образце недостаточно антигена для обнаружения (только антиген ELISA)
  • Образец, взят слишком рано при заболевании, свинье не удалось развить определяемый иммунный ответ (ELISA только на антитела)
    • При РРСС часто требуется 7-10 дней для сероконверсии.
    • Вирус гриппа присутствует в выделениях из носа только в течение первых 3-4 дней.
  • Образец взят слишком поздно при заболевании, и возбудитель больше не присутствует.
    • Вирус гриппа присутствует в выделениях из носа только в течение первых 3-4 дней.
  • Несоответствие целевого антитела/антигена
    • Различные штаммы гриппа (различия между H1N1 и H3N3, а также различия между различными классами H1N1)
  • Низкая распространенность в поголовье, и отобранные животные не были инфицированы.
    • Необходимо увеличить количество отобранных животных
  • Конкретное заболевание может не стимулировать достаточное количество антител для его обнаружения
    • Mycoplasma hyopneumoniae в основном прикрепляется к ресничкам в легких и не стимулирует высокую продукцию IgG в сыворотке.
      • Недавнее полевое заражение дает гораздо более сильные результаты ELISA
    • Вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae не стимулируют сильный иммунный ответ IgG.
      • Различные анализы ELISA по-разному определяют вакцины
      • Обычно только около 30% вакцинированных животных становятся сероконверсивными
  • Разбавление слабоположительного образца из-за объединения
      • Категорически не рекомендуется объединять образцы!

Положительный образец

  • Образец/поголовье действительно положительны на воздействие патогенов
  • Невозможно отличить инфекционный или неинфекционный образец
  • Невозможно отличить материнские антитела от естественного воздействия или вакцинации.
    • Большинство материнских антител исчезают к 8-12-недельному возрасту.
    • По мере взросления свиней значения ELISA должны со временем значительно снижаться.
    • Можно тестировать свиней с течением времени, чтобы подтвердить распад материнских антител, а также отсутствие воздействия в полевых условиях (отсутствие новых инфекций).
  • В зависимости от целевого патогена обнаружение белка (антигена/антитела) не всегда подтверждает заболевание.
    • Сыворотка, которая дает положительный результат ELISA на антитела к цирковирусу свиней типа 2 (ЦВС-2), подтверждает воздействие ЦВС-2 как на вакцинированных, так и на инфицированных животных (оба случая довольно распространены), но не подтверждает, связаны ли истощение или заболевание с ЦВС-2 или неэффективностью вакцины. Необходимо провести иммуногистопатологию легочной и/или лимфатической ткани, чтобы продемонстрировать заболевание, связанное с ЦВС-2.
    • Анализ может быть не в состоянии отличить воздействие вакцинного вируса/бактерий от модифицированной живой вакцины от инфекции дикого типа (только ИФА антител).
      • Применяется как к убитым, так и к модифицированным живым вакцинам
      • Полезно знать время вакцинации, хотя и не критично, так как животные могут оставаться положительными на некоторые заболевания в течение длительного периода времени (много месяцев).
  • Перекрестное загрязнение маловероятно, так как для получения положительного результата требуется большое количество загрязнения (зависит от концентрации).
Рисунок 2. Значение ELISA или титр во времени после иммунизации.

Рисунок 2. Значение ELISA или титр во времени после иммунизации.

  • Одно значение ELISA может не полностью идентифицировать стадию инфекции (необходим анамнез)
    • См. рис. 2
    • X = значение ELISA
    • Три разных момента вспышки могут дать одно и то же значение ELISA однако интерпретация и необходимые действия будут совершенно разными:
      • Точка А – начало инфекции – начинается вспышка; необходима реакция
      • Точка B – Поздняя стадия заражения – вспышка заканчивается; не так много, что можно сделать в этот момент
      • Точка C – Вторая вспышка – начинается вторая вспышка, необходимо принять меры по обеспечению биобезопасности/выявить причину повторной вспышки
    • Повторный сбор образцов от тех же животных через 10 дней–2 недели может потребоваться для дальнейшего определения стадии вспышки (наряду с клиническим анамнезом)
      • Если результаты второго образца выше, то, вероятно, вы в точке А
      • Если результаты второго образца значительно выше, то, вероятно, вы в точке C
      • Если результаты второго образца не меняются, вероятно, вы в фазе плато
      • Если результаты второй выборки ухудшатся, то, скорее всего, вы в точке B
  • Высокие значения S:P часто могут быть связаны с недавним контактом
    • Особенно после повторного контакта или ревакцинации (см. рис. 2) (ELISA только на антитела)
    • Важно отметить, что тот факт, что инфекция произошла недавно, не означает, что возбудитель все еще присутствует (т. е. животное является виремическим или бактериемическим) (ELISA только на антитела)
      • Это особенно верно в отношении вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС).
        • Свиньи могут быть отрицательными по ELISA, но при этом быть виремическими.
        • Свиньи могут иметь высокие значения антител ELISA и не быть виремическими
        • ПЦР-анализ используется для установления виремического статуса животных
  • Низкие значения S:P
    • Конкретное заболевание может не стимулировать достаточное количество антител для обнаружения
      • Mycoplasma hyopneumoniae в основном прикрепляется к ресничкам в легких и не стимулирует высокую продукцию IgG в сыворотке крови.
        • Недавнее полевое заражение дает гораздо более сильные результаты ELISA
      • Вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae не стимулируют сильный иммунный ответ IgG
        • Различные анализы ELISA по-разному определяют вакцины
        • Обычно только около 30% вакцинированных животных становятся сероконверсивными
    • Свиньи, которых лечат антибиотиками в течение нескольких недель, могут подавлять рост бактерий в течение этого времени, тем самым уменьшая воздействие болезни (но не устраняя ее), что приводит к более медленному или слабому иммунному ответу на воздействие.
      • Использование антибиотиков против Mycoplasma hyopneumoniae на ранних и средних стадиях доращивания
      • Использование антибиотиков против кишечных патогенов, таких как Lawsonia intracellularis, на ранних и средних стадиях доращивания.

Комментарии к статье

Эта область не предназначена для консультаций авторов по поводу своих статей, это место для открытых дискуссий между пользователями pig333.ru
Оставьте новый Комментарий

Ограниченный доступ пользователям 333. Чтобы отправить комментарий, Вам необходимо авторизироваться

сопутствующие статьи