Серотипирование полевых изолятов Actinobacillus pleuropneumoniae с помощью ПЦР

Определение серотипа Actinobacillus pleuropneumoniae (Арр) имеет важное значение для борьбы с ней, поскольку разные серотипы обладают разным вирулентным потенциалом (в зависимости от географического региона), и подобная информация может быть использована при подборе наиболее подходящей вакцины (Gottschalk, 2015). Исходя из капсулы, существует 18 известных серотипов Арр (Bossé и др., 2018a), из которых наиболее вирулентными являются 1, 5, 9 и 11. Потребность в NAD (никотинамид-аденин-динуклеотид) отличает биотип 1 от NAD-независимых изолятов биотипа 2.

По классике, для определения серотипа используют серологические тесты, среди которых: агглютинация, коагглютинация, иммунодиффузия, непрямая гемагглютинация и кольцеприципитация. Однако, они требуют специфических к высоким титрам антисывороток, а кросс-реакции между серотипами (3/6/8 и 1/9/11) являются проблематичными. Нами было обнаружено, что большее число британских и ирландских изолятов, серологически относимых к 3 серотипу, представляют собой серотип 8 (O’Neil и др., 2010). Учитывая эти обстоятельства, мы разработали молекулярные тесты, в которых с помощью полимерно-цепной реакции (ПЦР) идет амплифицирование серотип-специфических последовательностей ДНК в генах биосинтеза капсул (Bossé и др., 2014). Таргетирование этих серотип-специфических последовательностей позволило разработать тест, специфический для серотипа-16 (Bossé и др., 2017) и привело к недавнему открытию серотипов 17 и 18 (Bossé и др., 2018а). Открыв серотипы 16-18, мы решили создать тест на основе ПЦР, который способен был бы определять все известные серотипы Арр. Однако, серотипы 9 и 11 с помощью ПЦР не дифференцируются, так как их капусльные локусы практически идентичны (Bossé и др., 2018b), и серологическими тестами их нельзя разделить тоже (Gottschalk, 2015). Тест на основе ПЦР должен был подтвердить, что изолят - это Арр и детерминировать специфический серотип. Для подтверждения Арр, мы использовали праймеры, амплифицирующие область 418 bp Арр-специфического гена архIV (Schaller и др., 1999). При этом, в связи с большим количеством серотипов (n=18), нам пришлось разработать два теста на основе мультиплексной ПЦР (мПЦР), каждый из которых способен выявлять множество серотипов. мПЦР1 обнаруживает серотипы 1-12 и 15 (Рис. 1А), а мПЦР2 – серотипы 13-14 и 16-18 (Рис. 1Б). Изоляты, которые в процессе мПЦР1 амплифицируют только архIV-бэнд, затем тестируются с помощью мПЦР2.

Кроме того, мПЦР2 подтверждает биотип посредством праймеров, разработанных таким образом, чтобы амплифицировать участок 1339 гена nadV (который обеспечивает независимость от NAD). NadV-ампликон в 1339 bp обнаружен только в референтных штаммах биотипа 2 (серотипы 13-14). Следует отметить, что другие серотипы (т.е., 2, 4, 7 и 17) описываются как биотип 2, а некоторые изоляты североамериканского серотипа 13 – как биотип 1 (Gottschalk, 2015).

ДНК-матрицей для ПЦР может служить пурифицированная ДНК (как из культивируемых бактерий, так и из образцов тканей), получаемая с помощью коммерческих наборов, вываренных клеточных лизатов бактерий либо колоний из культуры на чашках. Пурифицированная ДНК дает наилучшие результаты, тогда как ПЦР колоний могут давать частично/ложно-отрицательные результаты, если эти колонии очень липкие и трудно поддаются лизированию, как показано для трех клинических изолятов серотипа-2, которые амплифицировали только серотип-специфическую полосу из колонии ПЦР, а с использованием пурифицированной ДНК, амплифицировали и ее, и архIV-специфическую полосу (Рис. 2). Иногда изоляты не амплифицируют архIV, даже если используется пурифицированная ДНК (Bossé и др., 2014). В этом случае, для подтверждения Арр могут быть использованы альтернативные архIV-праймеры (oAPXIV-TSP1/2) (Tegetmeyer и др., 2008). мПЦР1 и мПЦР2 могут применяться для идентификации новых серотипов, как мы это сделали для 17 и 18 (Bossé и др., 2018а). Изоляты Арр, которые продуцируют архIV-бэнд, но не серотип-специфические ампликоны, потенциально могут представлять собой новый серотип, хотя отсутствие серотип-специфической полосы может иметь место и из-за неправильно подобранного праймера для дивергентных изолятов, либо из-за присутствия какого-то инсерционного элемента, разрушающего локус капсулы. Подтвердит, которая из этих причин имела место, полногеномное секвенирование.

Суммируя все вышесказанное, мониторинг серотипов Арр, как в отдельном поголовье, так и в стране целиком, имеет важное значение для борьбы с этой болезнью. Наши ПЦР (мПЦР1 и мПЦР2) являются полезными инструментами для идентификации вирулентных серотипов, подбора правильных вакцин (приобретаемых или аутогенных), а также для недопущения ввода свиней-носителей потенциально вирулентных изолятов в здоровое поголовье. Кроме того, наш подход применим для идентификации новых серотипов Арр и он способен повысить качество диагностики.

Выражение признательности

В лаборатории, в которой работает автор, поддержку исследованиям в области Арр оказывает Научно-исследовательский Совет по биотехнологии и биологическим наукам Соединенного Королевства.