Читайте эту статью в:

Секвенирование и интерпретация его результатов при использовании в программах борьбы с РРСС

Полное представление о том, с какими разновидностями вируса приходится иметь дело при начале мероприятий по обузданию инфекции и борьбе с ней является критичным как для эффективного их мониторинга, так и для идентификации новых, интродуцированных на фермах или в регионе, штаммов.

Понедельник 21 Сентябрь 2015 (назад 3 года 9 месяцы 25 дни)
Нравится

Вступление

Геном вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРССВ) представлен одноцепочечной молекулой РНК, что объясняет его крайнюю подверженность генетическим мутациям. Это также делает каждый штамм вируса РРСС уникальным - настолько, что генотипирование является весьма полезным методом диагностики и борьбы с заболеванием. Диагностическое генотипирование проводится путем определения последовательности нуклеотидов на отрезке ДНК, копирующем геномный фрагмент вирусной РНК (секвенирование ДНК). Наиболее часто для этого в настоящее время используется фрагмент ORF5 – ген, кодирующий основной оболочечный гликопротеин. В значительной мере это обусловлено тем, что он обладает неограниченным генетическим разнообразием.

 

Диагностическое секвенирование ДНК

Разница между вирусами РРСС первого (европейский) и второго (американский) типа легко выявляется с помощью большинства диагностических ПЦР-тест-систем. В то же время, установление различий между отдельными штаммами каждого из этих двух генотипов требует проведения секвенирования ДНК. С этой целью биологические жидкости или ткани, содержащие вирус РРСС в умеренных или высоких концентрациях, обрабатываются таким образом, чтобы изолировать РНК, которая затем копируется на ДНК методом обратной транскрипции, после чего ген ORF5 амплифицируется с помощью ПЦР и попадает на оборудование для проведения секвенирования ДНК. Этот процесс почти полностью автоматизирован и обычно занимает от одного до трех дней. Полученные в результате необработанные данные поступают в диагностическую лабораторию для анализа. Стандартный отчет о результатах содержит описание нуклеотидных последовательностей исследованного штамма, его сходство со стандартными штаммами, используемыми в вакцинах. Некоторые лаборатории, помимо этого, предоставляют результаты сравнения со стандартными панелями изолятов вируса РРСС дикого типа, представленные в виде дендрограмм. Также, могут предоставляться данные о результатах сравнения с последовательностями РРССВ, описания которых содержатся в производственной базе данных.

 

Анализ последовательностей РРССВ

Схожесть или идентичность последовательностей выявляется путем сопоставления двух или более последовательностей с помощью компьютерной программы. Пример сопоставления нескольких последовательностей ORF5 с пяти различных ферм приведен на Рис.1. Попарные сравнения процентной степени их идентичности, лежащие в пределах от 81,2% до 99,8%, представлены в таблице. Дендрограмма результатов полигенетического анализа демонстрирует группировку схожих последовательностей (Рис.2). Ключевой вопрос, встающий перед производителями и ветеринарами, это – являются ли выявленные генетические различия в последовательностях обычными вариациями одного и того же штамма вируса РРСС или они свидетельствуют о присутствии на ферме различных штаммов?

Portion of the alignment of ORF5 sequences of PRRSV strains from 5 different farms

Рис.1. Фрагмент сопоставления последовательностей ORF5 штаммов вируса РРСС пяти разных ферм. С ферм 1, 4 и 5 было получено по нескольку последовательностей. Точки в последовательностях соответствуют позициям, идентичным референтному штамму Lelystad вируса РРСС первого типа.

 

Dendrogram

Рис.2. Дендрограмма последовательностей ORF5, полученных для пяти разных ферм. Пример расшифровки: на Ферме 1 присутствуют 2 несвязанных штамма. Степень идентичности трех последовательностей друг другу >99%, в то время, как четвертая соответствует им только на ~83%. Зато она соответствует вирусу Lelystad. Два штамма с Фермы 4 тесно связаны друг с другом (идентичны на 99,5%). На Ферме 5 присутствуют два несвязанных штамма. Степень соответствия трех штаммов друг другу >98%, а четвертому – только около 81%.

Таблица. Попарное представление идентичности всех сопоставленных последовательностей ORF5 серий образцов вируса РРСС первого типа в процентах.

1-4 1-6 1-9 1-25 2-10 3-1 4-4 4-3 5-351 5-358 5-470 5-473 Lelystad  
*** 83.5 83.3 83.7 93.2 92.6 86.1 86.0 88.1 88.0 83.2 88.3 98.7 1-4
  *** 99.2 99.7 84.2 83.0 86.0 86.0 81.4 81.2 86.3 81.4 82.1 1-6
    *** 99.5 84.5 83.3 85.6 85.6 81.4 81.2 86.5 81.4 81.9 1-9
      *** 84.5 83.3 86.0 86.0 81.7 81.5 86.8 81.7 82.2 1-25
        *** 98.2 86.6 86.5 91.1 90.9 84.2 90.4 93.3 2-10
          *** 84.4 84.2 90.2 90.0 83.3 89.7 92.9 3-1
            *** 99.5 82.5 82.7 90.6 82.5 84.8 4-4
              *** 82.3 82.5 90.9 82.2 84.6 4-3
                *** 99.8 81.0 98.3 88.4 5-351
                  *** 81.2 98.2 88.2 5-358
                    *** 80.9 83.2 5-470
                      *** 88.8 5-473
                        *** Lelystad

 

Интерпретация последовательностей РРССВ

Последовательность ORF5 содержит около 600 нуклеотидов. Общая мутируемость этого гена, по разным оценкам, составляет от 0,5% до 1% в год. Отличия в скорости генетических изменений определяются различными факторами невирусной природы. На репликацию и трансмиссивность вируса РРСС у свиней большое внимание оказывает уровень их специфического и неспецифического иммунитета, создающий сильное ингибирующее давление, приводящее к уменьшению числа вирусных копий. Уменьшение вирусной нагрузки приводит к снижению трансмиссивности, снижая тем самым общую репликацию вируса и степень его изменчивости. Таким образом, иногда может наблюдаться более высокая или более низкая генетическая изменчивость, выходящая за предполагаемые рамки 0,5%-1% в год.

Главным вопросом при проведении генетического анализа является вопрос о том, являются ли две последовательности близкородственными (двумя вариантами одного и того же штамма) или независимыми (принадлежащим двум несвязанным штаммам). Общепринято, что вывод о том, связаны ли изоляты вируса РРСС или нет, делается, исходя из степени схожести, попадающей в интервал достоверности 97% или 98%. Очевидно, что безоговорочное, сделанное без учета всех сопутствующих факторов, принятие за основу предпосылки о двух- или трехпроцентной генетической разнице между двумя изолятами может привести к неверным выводам. Различия между двумя вариантами одного и того же штамма, циркулирующего в поголовье на протяжении нескольких лет, постепенно выбьются за пределы данного интервала. Степень достоверности выводов о близкородственности может быть повышена получением доступа к дополнительной информации, включая даты и локализацию получения изолятов. Очень важен анализ, противопоставляющий новые последовательности РРССВ широкому референтному набору, являющемуся показательным для фермы, региона, используемой технологии или даже генетического разнообразия в глобальном масштабе.

Секвенирование ДНК штаммов вируса РРСС может вскрыть их родственность или независимость (Рис.2), но не может быть использовано для прогноза или объяснения степени иммунологической защиты или вспышек в иммунных поголовьях. Также, секвенирование ДНК не позволяет судить о клинических последствиях инфицирования данным конкретным штаммом, в силу того, что идентификация генетических маркеров вирулентности отсутствует.

В настоящее время, в основном в США, но также и в Европе осуществляется множество региональных проектов по борьбе с РРСС. Полное представление о том, с какими разновидностями вируса приходится иметь дело при начале мероприятий по обузданию инфекции и борьбе с ней является критичным как для эффективного их мониторинга, так и для идентификации новых, интродуцированных на фермах или в регионе, штаммов.

Статьи

Борьба с Mycoplasma hyopneumoniae и ее искоренение11-Сен-2015 назад 3 года 10 месяцы 5 дни

Комментарии к статье

Эта область не предназначена для консультаций авторов по поводу своих статей, это место для открытых дискуссий между пользователями pig333.ru
Оставьте новый Комментарий

Ограниченный доступ пользователям 333. Чтобы отправить комментарий, Вам необходимо авторизироваться

Незарегистрированный пользователь 333?регистрацияи доступ к ценам, поисковая система, ...
Это быстро и бесплатно
Вы зарегистрированы в 333?ЛОГИНЕсли Вы забыли свой пароль, мы вышлем Вам сюда

tags