Молекулярная диагностика РРСС: когда секвенирования только 4% недостаточно

Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) наряду с вирусом африканской чумы свиней является одним из наиболее экономически важных патогенов, влияющих на свиноводческую отрасль во всем мире. Недавнее появление агрессивных штаммов вируса РРСС, таких как высокопатогенный РРСС (HP-PRRSV) в Азии, Rosalia в Европе и L1C.5 в Северной Америке, вызвало дискуссию о необходимости дальнейшего улучшения диагностики и контроля вируса РРСС.

Использование ОТ-ПЦР для обнаружения генетического материала вируса РРСС широко применяется во всем мире для скрининга поголовья на наличие вируса.

Одним из шагов за пределами обнаружения РНК является генетическое секвенирование вируса РРСС, обычно проводимое с использованием техники Сэнгера. В глобальном масштабе часть вируса, наиболее часто используемая для секвенирования РРСС, — это ОРС5, хотя некоторые лаборатории сообщают о секвенировании ОРС7.

ОРС5 составляет около 4%, а ОРС7 — 2,4% генома вируса РРСС, и, таким образом, они не обеспечивают полного генетического покрытия всего генома.

В последние годы растет интерес к использованию секвенирования нового поколения (NGS) для восстановления полных геномов вируса РРСС для эпидемиологических исследований вируса РРСС в поголовье или производственной системе (рисунок 1).

Обычно в процессе репликации вирус РРСС претерпевает генетические изменения и мутации, которые потенциально могут привести к появлению новых вирусных вариантов. РРСС — один из вирусов, который, как известно, имеет высокую скорость мутаций, около 0,5–1% в год, неравномерно распределенных по различным областям генома, типам вируса и генетическим линиям, что приводит к постоянной генетической эволюции. Примечательно, что генетическая мутация и эволюция вируса могут происходить по всем генам, и секвенирование только части генома, например, ОРС5 или ОРС7, вероятно, упускает возможность обнаружить изменения, которые произошли за пределами секвенированной области (рисунок 1).

В этом случае NGS становится полезным инструментом, предоставляя возможность восстановить целый геном вируса РРСС для использования в эпидемиологических исследованиях.

Как ветеринары и производители могут воспользоваться преимуществами NGS

Чтобы максимально использовать полезность NGS, следует учитывать некоторые моменты:

• Привлечение ветеринара и лабораторного диагноста важно на ранних этапах для согласования диагностического вопроса, ожиданий и подхода к тестированию.
• Есть ли на ферме или в производственной системе референтная последовательность всего генома штамма вируса РРСС для сравнения?
  • Если нет, используйте NGS на положительных образцах РРСС ОТ-ПЦР с низкими значениями Ct, т. е. в идеале < 24, чтобы восстановить весь геном в качестве референтного штамма поголовья. Значение Ct обратно пропорционально количеству генетических копий вируса, присутствующих в образце, т. е. чем ниже Ct, тем выше ожидаемая вирусная нагрузка и потенциальный успех NGS;
  • Референтный штамм позволяет проводить последующее сравнение проспективно восстановленных геномов для понимания генетической эволюции вируса РРСС на ферме, в потоке и в системе.
• Какова цель проведения NGS?
• • Если цель заключается в обнаружении эволюции вируса на уровне всего генома: исследуйте легкие и сыворотку, поскольку эти образцы с большей вероятностью позволят восстановить весь геном.
  • Если цель заключается в понимании вирусного разнообразия на ферме или в поголовье, используйте типы образцов популяции, такие как технологическая жидкость, образцы ротовой жидкости или объединенные индивидуальные образцы, например, объединенная сыворотка с большей вероятностью позволит восстановить несколько вирусов, если они присутствуют в образце.
• Смешанные инфекции с двумя или более вирусами РРСС в поголовье являются реальностью (рисунок 2a), и если два вируса очень похожи, NGS может не восстановить целый геном;
• • Если в образце присутствует несколько вирусов, NGS может восстановить фрагменты генома, называемые «контигами», от разных вирусов, которые при сравнении с контрольным штаммом фермы могут помочь определить, присутствует ли в образце несколько вирусов (рисунок 2b);
• Наконец, обязательно наймите кого-то, кто поможет с генетическим анализом и сравнениями, а также скоординирует время выполнения, поскольку NGS, как правило, является медленным процессом, на завершение которого может уйти больше недели.

Какую эпидемиологическую информацию мы можем получить от NGS?

Сгенерированные результаты NGS могут помочь разобраться в следующих вопросах:

1. Эволюционировал ли вирус посредством случайных замен нуклеотидов в тех же геномных позициях? Насколько сильно изменился вирус между двумя временными точками и в каком геноме, т. е. в области(ях) ОРС, произошли эти изменения?
2. Эволюционировал ли вирус посредством вставок или делеций в своем геноме? 3. Произошло ли новое внедрение неродственного вируса на ферме, в поголовье или потоке?
3. Хотя это менее вероятно, но возможно, приобрел ли новый вирус изменения в геномных областях, на которые нацелена ОТ-ПЦР или секвенирование праймера/зонда Сэнгера, что привело к тому, что анализы не смогли обнаружиться?
4. Подвергся ли вирус рекомбинации, т. е. приобрел некоторые геномные области от двух или более родительских вирусов

Рекомбинация — естественный процесс эволюции вируса РРСС, который происходит, когда два вируса РРСС реплицируются в одной и той же клетке, образуя третий производный вирус. Рекомбинация будет более подробно рассмотрена в статье, опубликованной на pig333.com 9 июня 2025 года «Последствия дилеммы рекомбинации вируса РРСС».