Читайте эту статью в:

Серотипирование полевых изолятов Actinobacillus pleuropneumoniae с помощью ПЦР

Недавно созданный тест на основе ПЦР может помочь определить все известные серотипы Арр, и этим можно пользоваться при подборе наиболее подходящей вакцины.

Четверг 12 Декабрь 2019 (назад 1 месяцы 8 дни)
2 Нравится

Определение серотипа Actinobacillus pleuropneumoniae (Арр) имеет важное значение для борьбы с ней, поскольку разные серотипы обладают разным вирулентным потенциалом (в зависимости от географического региона), и подобная информация может быть использована при подборе наиболее подходящей вакцины (Gottschalk, 2015). Исходя из капсулы, существует 18 известных серотипов Арр (Bossé и др., 2018a), из которых наиболее вирулентными являются 1, 5, 9 и 11. Потребность в NAD (никотинамид-аденин-динуклеотид) отличает биотип 1 от NAD-независимых изолятов биотипа 2.

По классике, для определения серотипа используют серологические тесты, среди которых: агглютинация, коагглютинация, иммунодиффузия, непрямая гемагглютинация и кольцеприципитация. Однако, они требуют специфических к высоким титрам антисывороток, а кросс-реакции между серотипами (3/6/8 и 1/9/11) являются проблематичными. Нами было обнаружено, что большее число британских и ирландских изолятов, серологически относимых к 3 серотипу, представляют собой серотип 8 (O’Neil и др., 2010). Учитывая эти обстоятельства, мы разработали молекулярные тесты, в которых с помощью полимерно-цепной реакции (ПЦР) идет амплифицирование серотип-специфических последовательностей ДНК в генах биосинтеза капсул (Bossé и др., 2014). Таргетирование этих серотип-специфических последовательностей позволило разработать тест, специфический для серотипа-16 (Bossé и др., 2017) и привело к недавнему открытию серотипов 17 и 18 (Bossé и др., 2018а). Открыв серотипы 16-18, мы решили создать тест на основе ПЦР, который способен был бы определять все известные серотипы Арр. Однако, серотипы 9 и 11 с помощью ПЦР не дифференцируются, так как их капусльные локусы практически идентичны (Bossé и др., 2018b), и серологическими тестами их нельзя разделить тоже (Gottschalk, 2015). Тест на основе ПЦР должен был подтвердить, что изолят - это Арр и детерминировать специфический серотип. Для подтверждения Арр, мы использовали праймеры, амплифицирующие область 418 bp Арр-специфического гена архIV (Schaller и др., 1999). При этом, в связи с большим количеством серотипов (n=18), нам пришлось разработать два теста на основе мультиплексной ПЦР (мПЦР), каждый из которых способен выявлять множество серотипов. мПЦР1 обнаруживает серотипы 1-12 и 15 (Рис. 1А), а мПЦР2 – серотипы 13-14 и 16-18 (Рис. 1Б). Изоляты, которые в процессе мПЦР1 амплифицируют только архIV-бэнд, затем тестируются с помощью мПЦР2.

Рисунок 1. Серотип-специфическая детекция ампликонов из референтных АРР-штаммов с использованием: (А) мПЦР1 – для серотипов 1-12 и 15; и (Б) мПЦР2 – для серотипов 13-14 и 16-18. Референтный штаммы серотипов 1-18 = полосы 1-18. При обеих мПЦР виден ампликон 418 bp архIV, тем самым подтверждая, что образцы – это Арр (приведено с изменениями из Bossé и др., 2018b).

Рисунок 1. Серотип-специфическая детекция ампликонов из референтных АРР-штаммов с использованием: (А) мПЦР1 – для серотипов 1-12 и 15; и (Б) мПЦР2 – для серотипов 13-14 и 16-18. Референтный штаммы серотипов 1-18 = полосы 1-18. При обеих мПЦР виден ампликон 418 bp архIV, тем самым подтверждая, что образцы – это Арр (приведено с изменениями из Bossé и др., 2018b).

Кроме того, мПЦР2 подтверждает биотип посредством праймеров, разработанных таким образом, чтобы амплифицировать участок 1339 гена nadV (который обеспечивает независимость от NAD). NadV-ампликон в 1339 bp обнаружен только в референтных штаммах биотипа 2 (серотипы 13-14). Следует отметить, что другие серотипы (т.е., 2, 4, 7 и 17) описываются как биотип 2, а некоторые изоляты североамериканского серотипа 13 – как биотип 1 (Gottschalk, 2015).

ДНК-матрицей для ПЦР может служить пурифицированная ДНК (как из культивируемых бактерий, так и из образцов тканей), получаемая с помощью коммерческих наборов, вываренных клеточных лизатов бактерий либо колоний из культуры на чашках. Пурифицированная ДНК дает наилучшие результаты, тогда как ПЦР колоний могут давать частично/ложно-отрицательные результаты, если эти колонии очень липкие и трудно поддаются лизированию, как показано для трех клинических изолятов серотипа-2, которые амплифицировали только серотип-специфическую полосу из колонии ПЦР, а с использованием пурифицированной ДНК, амплифицировали и ее, и архIV-специфическую полосу (Рис. 2). Иногда изоляты не амплифицируют архIV, даже если используется пурифицированная ДНК (Bossé и др., 2014). В этом случае, для подтверждения Арр могут быть использованы альтернативные архIV-праймеры (oAPXIV-TSP1/2) (Tegetmeyer и др., 2008). мПЦР1 и мПЦР2 могут применяться для идентификации новых серотипов, как мы это сделали для 17 и 18 (Bossé и др., 2018а). Изоляты Арр, которые продуцируют архIV-бэнд, но не серотип-специфические ампликоны, потенциально могут представлять собой новый серотип, хотя отсутствие серотип-специфической полосы может иметь место и из-за неправильно подобранного праймера для дивергентных изолятов, либо из-за присутствия какого-то инсерционного элемента, разрушающего локус капсулы. Подтвердит, которая из этих причин имела место, полногеномное секвенирование.

Рисунок 2. Сравнение полос амплификации при ПЦР (мПЦР1) пурифицированных колонии (1-3) и ДНК (4-6) для трех клинических изолятов серотипа-2

Рисунок 2. Сравнение полос амплификации при ПЦР (мПЦР1) пурифицированных колонии (1-3) и ДНК (4-6) для трех клинических изолятов серотипа-2

Суммируя все вышесказанное, мониторинг серотипов Арр, как в отдельном поголовье, так и в стране целиком, имеет важное значение для борьбы с этой болезнью. Наши ПЦР (мПЦР1 и мПЦР2) являются полезными инструментами для идентификации вирулентных серотипов, подбора правильных вакцин (приобретаемых или аутогенных), а также для недопущения ввода свиней-носителей потенциально вирулентных изолятов в здоровое поголовье. Кроме того, наш подход применим для идентификации новых серотипов Арр и он способен повысить качество диагностики.

Выражение признательности

В лаборатории, в которой работает автор, поддержку исследованиям в области Арр оказывает Научно-исследовательский Совет по биотехнологии и биологическим наукам Соединенного Королевства.

сопутствующие статьи

Статьи

Комментарии к статье

Эта область не предназначена для консультаций авторов по поводу своих статей, это место для открытых дискуссий между пользователями pig333.ru
Оставьте новый Комментарий

Ограниченный доступ пользователям 333. Чтобы отправить комментарий, Вам необходимо авторизироваться

Незарегистрированный пользователь 333?регистрацияи доступ к ценам, поисковая система, ...
Это быстро и бесплатно
Вы зарегистрированы в 333?Если Вы забыли свой пароль, мы вышлем Вам сюда

tags