0
Проблемы, не столь уж новые, когда речь идет о вирусе РРСС
Не новость, что вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРССВ) обладает важными особенностями, которые способствуют постоянному повторному возникновению заболевания в поголовье, что приводит к значительным проблемам со здоровьем животных и экономическим потерям. Одной из этих особенностей является его быстрая способность мутировать и потенциально становиться более тяжелым и/или даже заражать животных, ранее «иммунных» к другому варианту вируса РРСС. По этой причине, чтобы понять «тип» вируса РРСС, присутствующий на ферме – будь то вирус из новой вспышки или «резидентный» вирус – стало очень распространенным анализировать геном вируса РРСС.
Эта задача обычно выполняется путем секвенирования важной части вируса РРСС, называемой геном ORF5; чтобы понять, какое эволюционное место занимает вирус и как он соотносится с предыдущим вирусом, обнаруженным на данном участке или в районе/регионе.
Информация о секвенировании вируса РРСС широко используется в этой области для:
- понять, какой вирус вызывает проблемы
- для получения рекомендаций по источнику вспышки
- для дифференциации вакцинных штаммов и «резидентных»/вновь интродуцированных штаммов
- для выбора вакцины и т.д.
В последнее время для классификации вирусов все чаще используется классификация «линия». Этот метод был разработан примерно в 2010 году (Shi et al., 2010), когда вирус РРСС был разделен на 9 различных линий; и дополнительно уточнены, когда вирус РРСС был разделен на подлинии.
Слон в комнате: достаточно ли секвенирования одного образца?
Секвенирование РРСС обычно стоит недешево, поэтому его чаще проводят в «особых ситуациях», а не регулярно (например, во время новых вспышек, после прививок вируса и т. д.). Кроме того, в этих случаях в подавляющем большинстве диагностических случаев для секвенирования используется только один образец или пул образцов (из многих, обычно отбираемых на ферме).
Это означает, что во многих случаях ветеринары, производители и другой ветеринарный персонал обычно используют единую информацию о последовательности, чтобы сделать важные выводы относительно источника вируса (особенно в случае новых вспышек), направить расследование вспышек и предоставить информацию для будущих вмешательств.
В нашем исследовании мы хотели подтвердить, что если мы секвенируем несколько образцов, взятых в один и тот же день, все образцы дадут одну и ту же последовательность или последовательности, которые будут «достаточно близкими», чтобы их можно было считать по крайней мере одной и той же линией вируса. Мы также хотели попробовать провести полногеномное секвенирование (WGS) вместе с секвенированием ORF5, чтобы посмотреть, сможем ли мы собрать больше информации. WGS может иметь преимущество, поскольку дает информацию обо всем вирусе, в то время как ORF5 исторически использовался, но рассказывает нам лишь часть истории. Однако, поскольку это все еще относительно недавняя разработка и может быть дорогостоящей (в США она стоит примерно в три раза дороже, чем секвенирование ORF5), мы все еще учимся ее интерпретировать, и наша «база данных» для сравнения намного меньше по сравнению с к ORF5.
Мы подозревали, что, учитывая высокую скорость мутаций РРСС и большие размеры современных свиноводческих предприятий, мы могли бы обнаружить несколько линий РРСС в рамках выборки, что вызвало бы беспокойство. Графическое изложение обоснования нашего исследования представлено на рис. 1.
Рисунок 1. Иллюстрация примера текущего общего подхода к определению варианта вируса РРСС на ферме (левая панель) и предлагаемой нами оценки для определения изменчивости резидентного вируса РРСС (правая панель).
Изучаем, сколько штаммов РРСС можно обнаружить на наших фермах
Мы включили в исследование пять ферм: 3 племенных поголовья и 2 доращивания; и отбирали пробы ежемесячно в течение примерно одного года с использованием различных типов проб (соскоб миндалин, ротовые жидкости, производственные жидкости). Мы всегда отбирали одни и те же места в корпусе, которые были пространственно разбросаны по всем объектам, чтобы попытаться получить максимально возможное представление о всем объекте. Каждый месяц у нас было до 16 образцов на участок, и все они тестировались с помощью количественной ПЦР; и после этого положительные образцы секвенировали ORF5.
Что мы узнали?
Наш самый важный вывод заключался в том, что в полевых условиях мы смогли обнаружить до трех различных линий вируса РРСС во время одного отбора проб в племенном поголовье и до двух на доращивании. Это показано на рис. 2.
Рисунок 2. Подлинии вируса РРСС, встречающиеся на исследуемых фермах (1–5) на протяжении всего периода отбора проб (в месяцах) для различных типов проб.
| Отбор образцов | |||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ферма | Тип образца | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1 | Производственная жидкость | L1H | L1H | ||||||||||
| Соскобы с миндалин | |||||||||||||
| 2 | Производственная жидкость | L1H | L1H | L1A | L1H | L1H | |||||||
| L1H | |||||||||||||
| L8† | |||||||||||||
| Соскобы с миндалин | L1H | ||||||||||||
| 3 | Производственная жидкость | L1H | L1H | L1H | L1H | ||||||||
| Соскобы с миндалин | |||||||||||||
| 4 | Ротовые жидкости | L5† | L1A | ||||||||||
| L5† | |||||||||||||
| Соскобы с миндалин | L1A | L5† | L5† | L1A | |||||||||
| L5† | |||||||||||||
| 5 | Ротовые жидкости | L1A | L1A | L5† | |||||||||
| Соскобы с миндалин | L1A | L1A | |||||||||||
Мы также отметили, что в случае нашего исследования образцы ротовой жидкости было очень сложно секвенировать, а обработку жидкостей было проще всего. Учитывая, что оба образца являются «составными», это потенциально можно объяснить общими более высокими значениями Ct, что указывает на меньшее количество вируса в ротовой жидкости по сравнению с технологическими жидкостями. Мы попытались попробовать WGS, но, в конце концов, нам не удалось получить полные последовательности всего генома ни из одного из наших образцов. Мы подозреваем, что это может быть связано с типами использованных нами образцов, но по этой теме необходимы дальнейшие исследования.
Эти результаты показывают, насколько важно учитывать секвенирование нескольких образцов при принятии важных решений, хотя мы понимаем, что это потребует более высоких затрат.
Благодарности
Национальный совет по свиноводству предоставил финансирование для этого проекта. Мы хотели бы поблагодарить ветеринаров и производителей, которые сыграли важную роль в сборе образцов.
